Bir önceki yazımda, DNA'nın keşfedilişinden ve klasik dizilimleme yaklaşımı olan Sanger dizilimleme (sekanslama | sequence) yönteminden bahsetmiştim. Bunun yanısıra, uygun teknolojiyi seçmenin ne kadar önemli olduğunu da toplu taşıma üzerinden örnekler vererek anlatmıştım.
Günümüzde çokça bilinmeyen ve bu nedenle de pek üzerinde durulmayan bir yöntemden bahsedeceğim bu yazımda. Hayalgücünüzü biraz zorlamanızı istiyorum: neredeyse tek yapabildiğiniz şey, elinizdeki DNA parçasını çok ufak (~800 bazlık) bölümler halinde okuyabilmek. Sonra birileri çıkıp (Edwin Southern) bir de hibridizasyon temelli bir yaklaşımla varlığını önceden bildiğiniz DNA parçalarını tespit etmek üzere bir teknik geliştiriyor, sene 1975. Elinizdeki en temel iki yöntem kabaca bunlar. Bunlar üzerine bir disiplin inşa etmek zorundaysanız, tüm şartları zorlarsınız.
Southern blot yöntemi mikrodizi teknolojisinin ortaya çıkmasına yol açtı, detaylar için mikrodizi [microarray] üzerine hazırlamış olduğum yazımı okuyabilirsiniz, SAGE'den orada da kısaca bahsetmiştim. Eğer üzerinde çalıştığınız genlerin nükleotit dizilimlerini biliyorsanız, o zaman Southern ya da mikrodizi sizin için kullanışlı olabilir ve gen ifade miktarlarını göreceli olarak elde edebilirsiniz. Ancak; 1) özel bir gen listesi yerine, o zamana kadar henüz keşfedilmemiş genleri, 2) henüz keşfedilmemiş genlere ait ifade miktarlarını, ve 3) genlere ait ifade miktarlarını göreceli [relative] olarak değil de mutlak [absolute] olarak bulmayı amaçlıyorsanız, bu iki yöntem sizin için yetersiz kalacaktır. Peki, mesela hücredeki mRNA'ları bir şekilde birleştirip DNA'ya dönüştürsek ve bunları DNA'yı dizilimliyor gibi dizilimlesek, o zaman hem keşfedilmemiş genleri, hem bunlara ait miktarları ve hem de iyi bir deney tasarımıyla bunlara ait mutlak ifade değerlerini bulamaz mıyız? Tek yapmamız gereken, hücredeki tek bir mRNA'yı bile kaçırmadan bir şekilde birleştirip DNA'ya çevirmek ve dizilimlemek!
Southern blot yöntemi mikrodizi teknolojisinin ortaya çıkmasına yol açtı, detaylar için mikrodizi [microarray] üzerine hazırlamış olduğum yazımı okuyabilirsiniz, SAGE'den orada da kısaca bahsetmiştim. Eğer üzerinde çalıştığınız genlerin nükleotit dizilimlerini biliyorsanız, o zaman Southern ya da mikrodizi sizin için kullanışlı olabilir ve gen ifade miktarlarını göreceli olarak elde edebilirsiniz. Ancak; 1) özel bir gen listesi yerine, o zamana kadar henüz keşfedilmemiş genleri, 2) henüz keşfedilmemiş genlere ait ifade miktarlarını, ve 3) genlere ait ifade miktarlarını göreceli [relative] olarak değil de mutlak [absolute] olarak bulmayı amaçlıyorsanız, bu iki yöntem sizin için yetersiz kalacaktır. Peki, mesela hücredeki mRNA'ları bir şekilde birleştirip DNA'ya dönüştürsek ve bunları DNA'yı dizilimliyor gibi dizilimlesek, o zaman hem keşfedilmemiş genleri, hem bunlara ait miktarları ve hem de iyi bir deney tasarımıyla bunlara ait mutlak ifade değerlerini bulamaz mıyız? Tek yapmamız gereken, hücredeki tek bir mRNA'yı bile kaçırmadan bir şekilde birleştirip DNA'ya çevirmek ve dizilimlemek!
Kulağa ne kadar da kolay geliyor, değil mi :) Bu yaklaşımın temel bir sorunu var: eğer hakikaten hücredeki tüm mRNA'ları birleştirebilirsek, ortaya çıkan devasa nükleotit diziliminin içeriğini öğrenmek çok büyük bir maliyet getirecektir, en azından Yeni Nesil Dizilimleme [Yeni Nesil Sekanslama | Next Generation Sequencing] çıkana kadar böyleydi. Yine de bu sorunu çözebilecek şöyle bir yaklaşım geliştirilebilir: bir mRNA'ya ait tüm nükleotit dizilimini almak yerine, o mRNA'yı temsil edebilecek kadar özgün bir kısmını alsak? Bunu PCR için primer tasarımı yaparken uyguluyoruz ve diyoruz ki, yaklaşık 20 bazlık bir DNA parçası bugünkü hesaplarımıza göre yeterince özgündür ve bir geni çoğu zaman bir diğerinden ayırt edebilir. İstisnaları mutlaka var ve gözardı da edilebilecek gibi değil, ancak bunun beraberinde getirdiği avantajları bir düşünsenize? Hele ki bu yaklaşımın 1995 yılında ortaya konulduğunu düşünün: henüz İnsan Genom Projesi fazlasıyla yavaş ilerliyordu ve farklı genomlara ilişkin bilgimiz bugüne kıyasla çok daha azdı. Dr. Victor Velculesco'nun geliştirdiği teknik şu şekilde özetlenebilir: her bir transkriptin tamamı yerine özel bir enzimle sadece başındaki 22 bazlık kısmını alıp bunları DNA'ya dönüştürerek birleştirmek, ardından da bu yeni DNA'yı dizilimlemek. Maliyet bir anda göreceli olarak azalıyor ve büyük çaplı mRNA çalışmaları mümkün hale geliyor. Ayrıca, tüm sonuçlar tek bir deney dizisinden elde edildiği için teknik hatalar da ortadan kalkmış oluyor (birden fazla gene ait çalışmaları qPCR ile gerçekleştirdiğinizde bu tarz hatalarla daha çok karşılaşabiliyorsunuz). Yine de o zamanları düşündüğümüzde dizilimleme maliyetinin o haliyle bile çok yüksek olacağını ve bu tarz çalışmaların ancak büyük merkezlerce yapılabileceğini tahmin edebilirsiniz.
Bu yaklaşımla her ne kadar maliyeti düşürmek amacıyla DNA parçalarını küçültseniz de, alternatif kırpılma [alternative splicing] başta olmak üzere aslında birçok hücresel bilgiyi kaçırıyorsunuz, ve bu gibi nedenler ve maliyet avantajından ötürü bu yöntem yerini mikrodizi'ye bıraktı. Düşünsenize, bu yöntem maliyet olarak mikrodizi tekniğine yaklaşsa ve mRNA'ların tamamını okuyabilsek, o zaman çok daha faydalı olmaz mıydı? Her bir mRNA'yı -ve dolayısıyla genleri- neredeyse teker teker sayabilir ve böylece sayıları ve alternatif kırpılmaya uğrayıp uğramadıkları hakkında daha güvenilir bir bilgiye sahip olabilirdik. İşte Yeni Nesil Dizilimleme [Yeni Nesil Sekanslama | Next Generation Sequencing] dünyasında bu tarz bir yaklaşım mümkün, ve bu tarz deneyler RNA-Seq olarak adlandırılıyor.
DNA ve RNA dünyasındaki temel motivasyonlardan ve ihtiyaçlardan mümkün olduğunca bahsettim, artık sıra mevcut teknolojilere geldi. Bir sonraki yazımda günümüzdeki güncel teknolojileri anlatacağım ve farklılıkları ile birbirlerine üstün yönlerini özetlemeye çalışacağım.
Sözün Özü:
Yeni Nesil Dizilimleme [Yeni Nesil Sekanslama | Next Generation Sequencing] teknolojisinin gelişmesini hızlandıran temel motivasyonlardan biri de büyük ölçekli mRNA çalışmalarına olan ihtiyaçtır. SAGE yöntemini bu tarz çalışmaların prototipi ve genel prensibi olarak düşünebiliriz, günümüzdeki deneysel yaklaşım ise RNA-Seq olarak adlandırılmaktadır.
Proje:
SAGE yöntemiyle herhangi bir hücredeki mRNA'ların miktarını tespit etmeye çalışsak, yaklaşık kaç sefer Sanger dizilimleme (sekanslama | sequencing) yapmaya ihtiyaç duyarız? Her bir dizilimlemenin maliyeti 25 TL olsa, tüm dizilimlemeler için yaklaşık ne kadarlık bir finansal kaynağa ihtiyaç duyarız
Meraklısına:
SAGE yönteminden elde edilen veriler günümüzde de referans olarak kullanılıyor; GeneCards'taki dokulara göre gen ifadesi bölümünde RNA-Seq ve Mikrodizi'nin yanı sıra SAGE yöntemine ait verileri de bulabilirsiniz