Bu serinin ilk yazısında PCR tekniğinden, ikinci yazısında ise hibridizasyondan bahsetmiştim. Bu yazıda ise, primer tasarımının arkasındaki dinamikleri anlamak adına en önemli kavramlardan biri olan termodinamik hesaplamalardan bahsedeceğim. Gözünüzü korkutmasın, matematiksel detaylara girmeden sadece mantığını anlatmaya çalışacağım.
Geçen yazıdan hatırladığınız üzere, primer tasarımdaki en temel amaç, hedeflediğimiz DNA bölgesine karşılık gelen [complementary] ve böylelikle tam bir hibridizasyona izin veren kısa bir DNA dizilimi oluşturmak. Bu kısa DNA dizilimine primer [başlatıcı/ateşleyici] diyoruz ve primer dememizin temel nedenlerinden biri de tüm süreci başlatması/ateşlemesi.
Bahsettiğimiz hibridizasyon süreci hidrojen bağlarının bağlanması ve kopması üzerine kurulu. Bu bağların kopup bağlanmasını kontrol etmek için de kullandığımız basit ancak etkin bir faktör var: sıcaklık. Sıcaklığı yeterince yükseltirsek fiziksek bağları koparabiliriz, yeterince düşürürsek fiziksek bağların tekrar bağlanması için ortam sağlayabiliriz. Bağları koparmak için 95 ºC çoğu zaman yeterli bir sıcaklık, böylece DNA'nın çift zincirli yapısını ikiye ayırarak iki ayrı tek zincir elde edebiliyoruz. Böylece tasarladığımız primerlerin bağlanabileceği bir DNA yapısına erişiyoruz. Bu aşamada sıcaklığı düşürür, örneğin oda sıcaklığına indirirsek ne olur? Fiziksel bağların kopmasına neden olan şartlar ortadan kalkar ve meydana gelebilecek her türlü kararlı fiziksel bağ ortaya çıkar! Bu duruma özgün olmayan bağlanma [non-specific binding] diyoruz ve bunun iki etkisinden söz edebiliriz. İlki, bu fiziksel bağların öyle kuvvetli olması ki, uzun taslak [template] DNA zincirlerinin de çeşitli biçimlerde bağlanmaya çalışması ve ortaya garip 3 boyutlu şekillerin çıkması. İkinci etki ise, normal şartlarda kararlı bir şekilde oluşmayacak olan primer - taslak DNA bağlantılarının ortaya çıkması. Yani, şartlar oluşursa, A bazının yerine T bazının gelmesini beklerken C bazının bağlanmış olduğunu görebiliriz. Bu, neredeyse her zaman istenmeyen bir durumdur (bu hatalı bağlanmaların istendiği bazı durumlar da var, bir kısmından yeri geldikçe söz edeceğim). Buna bir örnek vereyim:
Diyelim ki primer diziliminiz ATATA şeklinde olsun, bu primerin en kararlı şekilde bağlanacağı taslak DNA dizilimi de TATAT olacaktır. Ancak bu primer TATAC dizisine de bağlanabilir; ancak bu durumda daha kararsız olacaktır, yani bağlanma durumu eğer sıcaklık kritik bir seviyedeyse sona erebilir. Kimyadaki zayıf asit ve bazların denklemlerini hatırlayın: sürekli bir bağlanma kopma durumu söz konusudur ancak en kararlı bağlanma şekli tüm bağlanmaları büyük oranda domine eder. Yani örneğin pratikte, 100 primerin 49 tanesi TATAT dizilimine bağlanacakken, 1 primer ise TATAC dizisine bağlanacaktır. Eğer sıcaklığı biraz daha azaltırsanız, bu durumda 30 primer TATAT dizilimine bağlanacakken, 20 primer TATAC dizilimine bağlanabilir hale gelir. Eğer sıcaklığı yükseltirseniz, bu durumda da 100 primerden belki de sadece 20 tanesi TATAT dizilimine bağlanabilecekken, kalan 80 primeriniz ise herhangi bir taslak DNA dizilimine bağlanamayacaktır. PCR deneyimiz için istediğimiz ideal durum, denge durumudur. Yani 100 veya 99 primerin doğru DNA dizilimine bağlandığı durum.
Yukarıdaki paragrafta anlatılan durumdan çıkaracağımız sonuç şu: primer - taslak DNA bağlanmasını öyle bir dengede tutmalıyız ki, hem bu bağlanmalar kararlı bir şekilde ve büyük oranda oluşabilmeli, hem de özgün olmayan bağlanmalar engellenebilmeli. Bu kritik sıcaklığa erime sıcaklığı [temperature of melting] veya İngilizce karşılığının baş harflerinden oluşan Tm adını veriyoruz. Bir PCR deneyinin düzgün çalışması, Tm değerinin doğru ayarlanmasıyla doğrudan ilgili, yukarıdaki örneği tekrar gözünüzün önüne getirin. 0 ºC'deki buzlu suda olanla aynı durum söz konusu.
Artık bizi ilgilendiren asıl soru şu: bir primer (veya kısa bir nükleotit dizilimi) için Tm değerini nasıl hassas bir şekilde hesaplayabiliriz? Burada, yaklaşık 0.5 ºC'lik bir hassasiyetten bahsediyoruz. Geldik termodinamiğin bizi ilgilendiren kısmına :) Bu Tm değerini etkileyen ilk faktör grubu, primerimizin baz içeriği ve dizilimi. İkinci faktör grubu ise, primerimizin içerisinde bulunduğu ortamın iyon konsantrasyonunu belirleyen çözünürler.
Bu her bir faktörün Tm üzerinde nasıl bir etki ettiğini anlatmak için fazlasıyla teknik bir dile geçmek lazım ki, bu yazıda bunu amaçlamıyorum, hesaplamaları yapmak için bu aşamada arkaplandaki denklemleri de bilmeye gerek yok. Ancak burada önemli olan, deney tüpüne eklediğimiz her bir bileşenin Tm değeri üzerinde nasıl belirleyici bir etkisi olduğunu iyi anlamak ve hesaplamaları yaptırırken bilgileri doğru girmek. Bir örnekle devam edelim.
Elimizde çok kısa bir primer dizisi olsun (normal şartlar altında 18 bazdan daha kısa olması önerilmez, bunun nedenini de bir sonraki yazıda bulacaksınız): ATGCATGC. Bu primer dizisinin varsayılan [default] değerlerle ne kadarlık bir Tm değerine sahip olduğunu görmek için IDT Oligo Analyzer'a başvuracağız. Bu DNA dizilimini ilgili kutucuğa yerleştirip Analyze linkine tıkladığımızda karşımıza çıkan Tm değer 20.1 ºC. Şimdi Na+ konsantrasyonuyla oynayalım ve bu değeri iki katına (100 mM) çıkaralım, yeni Tm değerimiz 24.2! Bazı primer üreticileri size primerlerini gönderirken 50mM'lık Na+ solüsyonlarda gönderirken, bazıları ise 100mM'lık solüsyonları tercih eder. Bu fark primer uzunluğu arttıkça artar; halihazırda kullandığınız primerler için bu hesaplamayı yapın ve farkı görün! Belki de bu nedenle primeriniz çalışmıyordur, ne dersiniz? Oligonükleotit konsantrasyonu da bu kadar büyük olmasa da bir etkiye sahip, bu nedenle Tm hesaplarken her bir değeri elinizdeki sarf malzemelerine göre girdiğinizden emin olmalısınız.
Buraya kadar hep DNA-DNA arasında yer alan fiziksel bağlardan söz ettim. Bir de Taq polimeraz ile DNA arasında yer alan fiziksel bağlar var ki, bunlar üzerinde de Mg++ konsantrasyonu büyük ölçüde etkili. Özetle, magnezyum Taq polimerazın kofaktörü ve bu enzimin etkinliğini arttırıyor. Ancak aynı zamanda ortamdaki magnezyum konsantrasyonu fazla olduğunda da çift zincirli DNA'nın yeterince ayrılmamasına da neden olabiliyor. IDT Oligo Analyzer'da magnezyum konsantrasyonunu arttırdığınızda primeriniz için hesaplanan Tm değerinin büyük ölçüde arttığını göreceksiniz; aynı etki taslak DNA üzerinde de oluyor. Tam da bu noktada kaliteli PCR karışımının [master mix] ne kadar önemli olduğu ortaya çıkıyor: bu değerler ne kadar optimize edilmişse, PCR deneyiniz de o kadar başarılı olacaktır. Sıradan bir PCR karışımı [master mix] için ödediğinize göre daha fazla ödersiniz ancak daha az zaman kaybedersiniz ve daha çok PCR çıktısı elde edersiniz.
Son olarak bahsedeceğim ve Taq polimeraz ile DNA arasındaki fiziksel bağların kuvvetini etkileyen faktör ise, kullandığınız polimeraz enzimin cinsi. Piyasadaki çoğu Taq polimeraz enzimi, belli bir seviyeye kadar oluşabilecek hibridizasyon hatalarına [mismatch] müsamaha gösterir [tolerate] ve böylece sizin farkında olmadığınız ancak taslak DNA'da varolan bir mutasyon veya SNP gerçekleştirdiğiniz deneyi neredeyse hiç etkilemez. Ancak bazen, örneğin bir mutasyonun var olup olmadığını anlamak istediğinizde, bu tür bir hata payı dahi kabul edilemez. Bu ve benzeri durumlar için protein mühendisliği yaklaşımlarıyla geliştirilmiş, küçültülmüş veya büyütülmüş Taq polimerazlar da mevcuttur. Bu nedenle, gerçekleştirdiğiniz deneyin amacının ne olduğunu iyi belirlemeniz ve enziminizi buna göre seçmelisiniz.
Sözün Özü:
Tasarladığınız primerin Tm değerini etkileyen birçok faktör vardır ve bunların çok büyük bir kısmı kontrol altına alınabilir. Bu nedenle, IDT Oligo Analyzer gibi bir web aracını kullanarak ve konsantrasyon bilgilerini doğru girerek gerçeğe çok yakın Tm değerini hesaplayabilir ve optimizasyon deneylerinizi büyük ölçüde azaltabilirsiniz. Bir diğer etken olan PCR karışımını [master mix] kaliteli ve çalışmanıza uygun bir şekilde seçtiğinizde ise yine hem zaman kazanır, hem de daha az sarf malzemesiyle daha çok PCR çıktısı elde edebilirsiniz. PCR deneylerinizde sıkıntılar yaşıyorsanız Bio-Rad'ın PCR karışımlarını [master mix] denemenizi öneririm.
Proje:
Yakınlarda bir PCR deneyi yaptıysanız veya yapacaksanız, elinizdeki primer tüpündeki ve PCR karışımındaki [master mix] konsantrasyon değerlerini IDT Oligo Analyzer'a koyarak Tm değerini tekrar hesaplayın, bakalım değişecek mi? Elinizde bir primer yoksa da, IDT Oligo Analyzer üzerinde hayali primerlerle ve farklı iyon konsantrasyonlarıyla elde edeceğiniz Tm değerlerini karşılaştırın: primere ait DNA dizilimi ve GC oranı farklı iyon konsantrasyonlarıyla birleşince sonuçları ne kadar etkiliyor?
Meraklısına:
PCR basit ancak tam da bu nedenle fazlasıyla basite alınan bir deney türü. Bu yazıda bahsedilen termodinamik hesaplamaların detaylarına Santa Lucia 1998 makalesinden ulaşabilirsiniz.
Geçen yazıdan hatırladığınız üzere, primer tasarımdaki en temel amaç, hedeflediğimiz DNA bölgesine karşılık gelen [complementary] ve böylelikle tam bir hibridizasyona izin veren kısa bir DNA dizilimi oluşturmak. Bu kısa DNA dizilimine primer [başlatıcı/ateşleyici] diyoruz ve primer dememizin temel nedenlerinden biri de tüm süreci başlatması/ateşlemesi.
Bahsettiğimiz hibridizasyon süreci hidrojen bağlarının bağlanması ve kopması üzerine kurulu. Bu bağların kopup bağlanmasını kontrol etmek için de kullandığımız basit ancak etkin bir faktör var: sıcaklık. Sıcaklığı yeterince yükseltirsek fiziksek bağları koparabiliriz, yeterince düşürürsek fiziksek bağların tekrar bağlanması için ortam sağlayabiliriz. Bağları koparmak için 95 ºC çoğu zaman yeterli bir sıcaklık, böylece DNA'nın çift zincirli yapısını ikiye ayırarak iki ayrı tek zincir elde edebiliyoruz. Böylece tasarladığımız primerlerin bağlanabileceği bir DNA yapısına erişiyoruz. Bu aşamada sıcaklığı düşürür, örneğin oda sıcaklığına indirirsek ne olur? Fiziksel bağların kopmasına neden olan şartlar ortadan kalkar ve meydana gelebilecek her türlü kararlı fiziksel bağ ortaya çıkar! Bu duruma özgün olmayan bağlanma [non-specific binding] diyoruz ve bunun iki etkisinden söz edebiliriz. İlki, bu fiziksel bağların öyle kuvvetli olması ki, uzun taslak [template] DNA zincirlerinin de çeşitli biçimlerde bağlanmaya çalışması ve ortaya garip 3 boyutlu şekillerin çıkması. İkinci etki ise, normal şartlarda kararlı bir şekilde oluşmayacak olan primer - taslak DNA bağlantılarının ortaya çıkması. Yani, şartlar oluşursa, A bazının yerine T bazının gelmesini beklerken C bazının bağlanmış olduğunu görebiliriz. Bu, neredeyse her zaman istenmeyen bir durumdur (bu hatalı bağlanmaların istendiği bazı durumlar da var, bir kısmından yeri geldikçe söz edeceğim). Buna bir örnek vereyim:
Diyelim ki primer diziliminiz ATATA şeklinde olsun, bu primerin en kararlı şekilde bağlanacağı taslak DNA dizilimi de TATAT olacaktır. Ancak bu primer TATAC dizisine de bağlanabilir; ancak bu durumda daha kararsız olacaktır, yani bağlanma durumu eğer sıcaklık kritik bir seviyedeyse sona erebilir. Kimyadaki zayıf asit ve bazların denklemlerini hatırlayın: sürekli bir bağlanma kopma durumu söz konusudur ancak en kararlı bağlanma şekli tüm bağlanmaları büyük oranda domine eder. Yani örneğin pratikte, 100 primerin 49 tanesi TATAT dizilimine bağlanacakken, 1 primer ise TATAC dizisine bağlanacaktır. Eğer sıcaklığı biraz daha azaltırsanız, bu durumda 30 primer TATAT dizilimine bağlanacakken, 20 primer TATAC dizilimine bağlanabilir hale gelir. Eğer sıcaklığı yükseltirseniz, bu durumda da 100 primerden belki de sadece 20 tanesi TATAT dizilimine bağlanabilecekken, kalan 80 primeriniz ise herhangi bir taslak DNA dizilimine bağlanamayacaktır. PCR deneyimiz için istediğimiz ideal durum, denge durumudur. Yani 100 veya 99 primerin doğru DNA dizilimine bağlandığı durum.
Yukarıdaki paragrafta anlatılan durumdan çıkaracağımız sonuç şu: primer - taslak DNA bağlanmasını öyle bir dengede tutmalıyız ki, hem bu bağlanmalar kararlı bir şekilde ve büyük oranda oluşabilmeli, hem de özgün olmayan bağlanmalar engellenebilmeli. Bu kritik sıcaklığa erime sıcaklığı [temperature of melting] veya İngilizce karşılığının baş harflerinden oluşan Tm adını veriyoruz. Bir PCR deneyinin düzgün çalışması, Tm değerinin doğru ayarlanmasıyla doğrudan ilgili, yukarıdaki örneği tekrar gözünüzün önüne getirin. 0 ºC'deki buzlu suda olanla aynı durum söz konusu.
Artık bizi ilgilendiren asıl soru şu: bir primer (veya kısa bir nükleotit dizilimi) için Tm değerini nasıl hassas bir şekilde hesaplayabiliriz? Burada, yaklaşık 0.5 ºC'lik bir hassasiyetten bahsediyoruz. Geldik termodinamiğin bizi ilgilendiren kısmına :) Bu Tm değerini etkileyen ilk faktör grubu, primerimizin baz içeriği ve dizilimi. İkinci faktör grubu ise, primerimizin içerisinde bulunduğu ortamın iyon konsantrasyonunu belirleyen çözünürler.
Bu her bir faktörün Tm üzerinde nasıl bir etki ettiğini anlatmak için fazlasıyla teknik bir dile geçmek lazım ki, bu yazıda bunu amaçlamıyorum, hesaplamaları yapmak için bu aşamada arkaplandaki denklemleri de bilmeye gerek yok. Ancak burada önemli olan, deney tüpüne eklediğimiz her bir bileşenin Tm değeri üzerinde nasıl belirleyici bir etkisi olduğunu iyi anlamak ve hesaplamaları yaptırırken bilgileri doğru girmek. Bir örnekle devam edelim.
Elimizde çok kısa bir primer dizisi olsun (normal şartlar altında 18 bazdan daha kısa olması önerilmez, bunun nedenini de bir sonraki yazıda bulacaksınız): ATGCATGC. Bu primer dizisinin varsayılan [default] değerlerle ne kadarlık bir Tm değerine sahip olduğunu görmek için IDT Oligo Analyzer'a başvuracağız. Bu DNA dizilimini ilgili kutucuğa yerleştirip Analyze linkine tıkladığımızda karşımıza çıkan Tm değer 20.1 ºC. Şimdi Na+ konsantrasyonuyla oynayalım ve bu değeri iki katına (100 mM) çıkaralım, yeni Tm değerimiz 24.2! Bazı primer üreticileri size primerlerini gönderirken 50mM'lık Na+ solüsyonlarda gönderirken, bazıları ise 100mM'lık solüsyonları tercih eder. Bu fark primer uzunluğu arttıkça artar; halihazırda kullandığınız primerler için bu hesaplamayı yapın ve farkı görün! Belki de bu nedenle primeriniz çalışmıyordur, ne dersiniz? Oligonükleotit konsantrasyonu da bu kadar büyük olmasa da bir etkiye sahip, bu nedenle Tm hesaplarken her bir değeri elinizdeki sarf malzemelerine göre girdiğinizden emin olmalısınız.
Buraya kadar hep DNA-DNA arasında yer alan fiziksel bağlardan söz ettim. Bir de Taq polimeraz ile DNA arasında yer alan fiziksel bağlar var ki, bunlar üzerinde de Mg++ konsantrasyonu büyük ölçüde etkili. Özetle, magnezyum Taq polimerazın kofaktörü ve bu enzimin etkinliğini arttırıyor. Ancak aynı zamanda ortamdaki magnezyum konsantrasyonu fazla olduğunda da çift zincirli DNA'nın yeterince ayrılmamasına da neden olabiliyor. IDT Oligo Analyzer'da magnezyum konsantrasyonunu arttırdığınızda primeriniz için hesaplanan Tm değerinin büyük ölçüde arttığını göreceksiniz; aynı etki taslak DNA üzerinde de oluyor. Tam da bu noktada kaliteli PCR karışımının [master mix] ne kadar önemli olduğu ortaya çıkıyor: bu değerler ne kadar optimize edilmişse, PCR deneyiniz de o kadar başarılı olacaktır. Sıradan bir PCR karışımı [master mix] için ödediğinize göre daha fazla ödersiniz ancak daha az zaman kaybedersiniz ve daha çok PCR çıktısı elde edersiniz.
Son olarak bahsedeceğim ve Taq polimeraz ile DNA arasındaki fiziksel bağların kuvvetini etkileyen faktör ise, kullandığınız polimeraz enzimin cinsi. Piyasadaki çoğu Taq polimeraz enzimi, belli bir seviyeye kadar oluşabilecek hibridizasyon hatalarına [mismatch] müsamaha gösterir [tolerate] ve böylece sizin farkında olmadığınız ancak taslak DNA'da varolan bir mutasyon veya SNP gerçekleştirdiğiniz deneyi neredeyse hiç etkilemez. Ancak bazen, örneğin bir mutasyonun var olup olmadığını anlamak istediğinizde, bu tür bir hata payı dahi kabul edilemez. Bu ve benzeri durumlar için protein mühendisliği yaklaşımlarıyla geliştirilmiş, küçültülmüş veya büyütülmüş Taq polimerazlar da mevcuttur. Bu nedenle, gerçekleştirdiğiniz deneyin amacının ne olduğunu iyi belirlemeniz ve enziminizi buna göre seçmelisiniz.
Sözün Özü:
Tasarladığınız primerin Tm değerini etkileyen birçok faktör vardır ve bunların çok büyük bir kısmı kontrol altına alınabilir. Bu nedenle, IDT Oligo Analyzer gibi bir web aracını kullanarak ve konsantrasyon bilgilerini doğru girerek gerçeğe çok yakın Tm değerini hesaplayabilir ve optimizasyon deneylerinizi büyük ölçüde azaltabilirsiniz. Bir diğer etken olan PCR karışımını [master mix] kaliteli ve çalışmanıza uygun bir şekilde seçtiğinizde ise yine hem zaman kazanır, hem de daha az sarf malzemesiyle daha çok PCR çıktısı elde edebilirsiniz. PCR deneylerinizde sıkıntılar yaşıyorsanız Bio-Rad'ın PCR karışımlarını [master mix] denemenizi öneririm.
Proje:
Yakınlarda bir PCR deneyi yaptıysanız veya yapacaksanız, elinizdeki primer tüpündeki ve PCR karışımındaki [master mix] konsantrasyon değerlerini IDT Oligo Analyzer'a koyarak Tm değerini tekrar hesaplayın, bakalım değişecek mi? Elinizde bir primer yoksa da, IDT Oligo Analyzer üzerinde hayali primerlerle ve farklı iyon konsantrasyonlarıyla elde edeceğiniz Tm değerlerini karşılaştırın: primere ait DNA dizilimi ve GC oranı farklı iyon konsantrasyonlarıyla birleşince sonuçları ne kadar etkiliyor?
Meraklısına:
PCR basit ancak tam da bu nedenle fazlasıyla basite alınan bir deney türü. Bu yazıda bahsedilen termodinamik hesaplamaların detaylarına Santa Lucia 1998 makalesinden ulaşabilirsiniz.