Primer tasarımı hakkında hap gibi tek bir yazı bekleyenleri biraz hayal kırıklığına uğratabilir bu yazı dizisi, ancak bu bile olması gerekenin gayet özetlenmiş hâli maalesef. Şöyle bir örnek vereyim: bir yapı marketine girdiniz ve evdeki işlerinizi gayet kolaylaştıracak çok fonksiyonlu bir matkap setini gayet uygun bir fiyata aldınız diyelim. Bu konuda bir deneyiminiz yoksa (yani bu sizin ilk matkap setinizse) güç ayarını ve uç seçimini büyük bir ihtimalle yanlış seçer ve ya normalden daha fazla zaman harcar, ya uca zarar verir, ya da matkaba zarar verirsiniz. Reklam kokan bir ifadeyle, kontrolsüz güç, güç değildir. Bu nedenle, biraz sıkıcı olsa da, okumaya devam.Önceki yazımda PCR yönteminden bahsetmiştim ve üç kavramdan söz etmiştim, bu yazıda ilkinden, hibridizasyondan bahsedeceğim. Genomik tekniklerin neredeyse tamamı, A=T ve G≡C bazları arasındaki fiziksel kuvvete, yani Hidrojen bağlarına dayanır. Hibridizasyon olayını daha iyi anlamak için biraz hayal gücüne başvuralım. Doğal bir mıknatısın iki kutbu vardır hatırlarsınız; N [kuzey] ve S [güney]. Şimdi, her bir bazı, dışa bakan (baz-şeker-fosfat yapısının baz kısmının ucunu düşünün) ucunda birer mıknatısa sahipmiş gibi düşüneceğiz. A ve T bazlarının dış kısmında ikişer, G ve C bazlarının dış kısmında ise üçer mıknatısın var olduğunu hayal edin ve bu mıknatıslar aşağıda yer alan resimlerdeki gibi dizilmiş olsun:
Mıknatıslarla düşününce bazı şeyler daha kolay anlaşılmaya başlanmıştır sanırım. Şimdi bu bazların her birini, sadece ekseni etrafında dönebilen ancak bükülmesi pek de kolay olmayan, 0,5 cm kalınlığında plastik bir ipin üzerine dizelim. İşimi kolaylaştırmak adına sadece G ve A bazlarını kullanarak 5 bazlık bir dizi oluşturacağım: GAAGG. Bunun karşısına hangi bazların geleceğini tamamen mıknatısların kutuplarına bakarak karar verin lütfen. Önemli bir hatırlatma yapmalıyım; DNA kutuplu [polar] bir moleküldür; yani her bir zincirin bir başı ( 5' ucu), bir de sonu (3' ucu) vardır. Bu da, baz-şeker-fosfat yapısının kutuplu olmasından kaynaklanır. Yani, yukarıdaki şekillerde gördüğünüz G ve A bazları 5'->3' yönündeyken, C ve T bazları ise 3'<-5' yönünde gösterilmiştir. Bu da demek oluyor ki, C ve T bazlarını G ve A bazlarının yer aldığı DNA zincirine eklemek isteseydim180 derece çevirmeliydim. İşin bu kısmı biraz uğraştırıcı, yine de aşağıdaki şekilde ufak bir örneğini bulabilirsiniz.
Mıknatıslı yapıya baktığımızda, A bazının karşısına gelebilecek en uygun bazın T olduğu, C bazının bir türlü karşı karşıya gelemeyeceği, G bazının ise (180 derece çevrilmiş halini düşünün, çünkü karşı zincire geçiyor) sadece bir mıknatısının bağlanabileceğini ancak diğerlerinin itici kuvvet uygulayacağını görebilirsiniz. Bu örnekteki yanıltıcı durum ise, A bazının karşısına A bazının gelebileceğidir. Şekilde 3 boyutlu yapıyı basitleştirmek adına 2 boyuta indirdiğimiz için böyle bir şey karşımıza çıkıyor ancak gerçek hayatta da bu iki baz, bir DNA zincirinin parçasıyken karşı karşıya gelemiyor.Şimdiye kadar anlattıklarımdan çıkarabileceğimiz bir sonuç var, o da şu: bir DNA zincirine karakteristik özelliklerini veren şey, mıknatısların dizilimi. DNA normal şartlar altında çift zincirli bir yapıda olmayı sever ve bunun için elinden geleni yapar; tam da bu nedenle, eğer karşısında tam olarak bağlanabileceği ve kendi mıknatıs dizilim yapısına uygun başka bir zincir varsa bağlanmayı gerçekleştirerek çift zincirli yapıda kalır.
Gelelim primer tasarımına. Yukarıda bahsettiğim durum şu anlama da geliyor: eğer, taslak bir DNA zincirine bağlanabilecek yaklaşık 20 bazlık kısa bir DNA zinciri tasarlarsanız, bu zincir bağlanabileceği ne kadar yer varsa hepsine bağlanmaya çalışır! Hatta, becerebilirse, kendi kendine de bağlanmaya çalışır. Eğer ortamda başka bir DNA zinciri varsa -örneğin, başka bir primer türü- ona da bağlanmaya çalışır! Eğer tamamına bağlanamıyorsa, o zaman da bağlanabildiği kadarlık kısmına bağlanmaya çalışır; bu durum karşımıza, primer ikilisi [primer dimer] denilen durum olarak ortaya çıkar.
Primer uzunluğunun 18-22 baz arasında seçilmesi tesadüf değildir; amaç, bu her yere bağlanmaya çalışan DNA zincirlerinin sadece kendine özgü [specific] yerlere bağlanması için bir hesaplama sonucu karar verilen bir uzunluktur; bunun arka planındaki yaklaşıma son yazıda değineceğim. Primerlerin kendi kendine bağlanmasına devam edelim.
Primerlerin taslak DNA'daki hedef yerine kendi içerisinde bağlanma durumu PCR reaksiyonunu mahveden ve kesinlikle istemediğimiz bir durumdur. Bunun 3 şekilde ortaya çıkabileceğini söyleyebiliriz:
1) Primerin kendi içerisinde bir saç tokası [hairpin] şeklinde hibridize olması: Eğer, primer dizinizin iki ucundaki mıknatıs dizilimi şekil olarak birbirini tamamlıyorsa ve bu dizi kıvrılabilecek kadar uzunsa, bu muhtemel bir durumdur. TGGAGCA dizilimini düşünün; aşağıdaki örnekte göreceğiniz üzere, TG ve CA birbirleriyle kararlı [stable] bir şekilde bağ oluşturabilir veya hibridizasyon gerçekleştirebilir.
2) Primerin, yine aynı tür bir primerle uçlarından hibridize olması: Bu kez bir primer kendi içerisinde değil de, yine aynı dizilime sahip başka bir primerle etkileşime geçebilir. TATAGCG baz dizilimli bir primer düşünün, ve yine aynı mıknatıs modelini hayalinizde canlandırın. Karşınıza aşağıdaki gibi bir resim çıkacaktır (5'-3' kutuplanmasına dikkat):
3) Primerin, başka tür bir primerle uçlarından hibridize olması: Bu kez de, aynı ortamda bulunan fakat dizilimleri farklı iki primeri (forward ve reverse primerler) düşünün; ilkinin dizilimi [5']TATAATC[3'], diğerininki ise [5']TATATAG[3'] olsun. Tahmin edeceğiniz üzere, bu iki primer de TATA uçlarından hibridize olabilirler ve sonuçta aşağıdaki şekil ortaya çıkar (5'-3' kutuplanmasına dikkat):
Eğer primer(ler)iniz, hedef bölgeye bağlanmak yerine, kendi içlerinde hibridize olmayı daha çok tercih ederlerse, DNA'yı çoğaltacak olan Taq Polimeraz enzimi hedef bölge yerine primerlerinizi çoğaltır, ya da çoğaltacak bir hedef bulamaz. Bu durumda ya PCR reaksiyonu hiç çalışmaz, ya da çalışır ancak sadece primer ikililerini [primer dimers] çoğaltır ve amacınıza ulaşamazsınız.
Bir sonraki yazıda, PCR reaksiyonunun meydana gelmesi için gerekli şartlardan ve basitleştirilmiş haliyle termodinamik kurallardan (gözünüz korkmasın) bahsedeceğim. Böylece, bir deneyin neden çalışıp neden çalışmayacağına ilişkin bir öngörümüz olacak. Aynı zamanda, gerektiğinde deneyimize çeşitli parametreleri kullanarak müdahale edebilecek ve çoğaltılması zor bölgeler için muhtemel çözüm yollarını göreceğiz.
Sözün Özü:
Her bir bazın 3 boyutlu yapısının meydana getirdiği çekim kuvveti alanları (mıknatıslar), o bazın başka hangi bazla biraraya geleceğini belirler ve bu çekim olayına hibridizasyon denir. Hibridizasyon, meydana gelebileceği her durumda ortaya çıkmaya çalışır ve bu durum istenmeyen bağlanmaların da oluşmasına sebep olabilir.
Proje:
Bir DNA diziliminde toplam kaç hidrojen bağı olduğunu nasıl hesaplarız?
TTGATGCTGGTGTAAGTGAACATTCAGGTGATTGGTTGGATCAGGATTCAGTTTCAGATC DNA diziliminde kaç hidrojen bağı vardır?
Meraklısına:
Hidrojen bağlarının miktarına bakarak iki diziyi ayırdetmeye yarayan birkaç yöntem vardır; bunlardan biri ise erime eğrisi analizi [melting curve analysis] adı verilen yöntemdir. Basit bir yaklaşımla iki dizinin nasıl ayırt edilebileceğine ilişkin bu yönteme bir göz atabilirsiniz.