Primer tasarımı çok enterasan bir konu esasen. İşin bir boyutu, 1) genomik tekniklerin neredeyse tamamının dayandığı hibridizasyon (A-T ve G-C bazlarının karşılıklı olarak fiziksel kuvvetlerle bir arada kalması) kavramının çok iyi anlaşılmasına dayanıyor. İşin diğer yanı, 2) termodinamik denklemlerdeki parametrelerin yerli yerince belirlenmesiyle doğrudan alakalı. Bir diğer boyut ise, 3) her türlü hesaplama sonucu tasarlanan birçok alternatif primerin genomda doğru bir yere konumlandırılmasını temel alıyor. Her ne kadar karışık ve karmaşık bir süreç olsa da, artık çevrimiçi [online] araçlarla bu iş neredeyse çocuk oyuncağı. Tam olarak değil. Yine de, işinizi gayet kolaylaştıracak bir çevrimiçi aracı da bir yandan anlatarak süreci mümkün olduğunca acısız geçirmeniz için elimden geleni yapacağım.
Bu tür konularda arka planda yer alan bilgilere hakim olmak sandığınızdan çok daha hayati olabilir. Geçmişte eski bir ortağımla gerçekleştirdiğimiz ve altı haneli bütçesi olan bir Ar-Ge çalışması, eski ortağımın deneyleri ve primerleri hatalı tasarlamasından ve isimlendirmesinden ötürü büyük oranda başarısızlıkla sonuçlanmıştı. Kendisi gayet iyi bir üniversitede doktora yapmış, tez sürecinde yoğun bir şekilde primer tasarlamış ve birçok PCR deneyi yapmış olmasına rağmen, konu standart primer tasarımının dışına birazcık çıktığı anda hatalar ardarda gelmişti. Projeyi yarıda bırakıp Ankara'daki bir üniversitede Yard. Doç. kadrosu aldığında ise hatalı tasarımların, karıştırılmış primerlerin ve çalışması zaten imkansız olan deneylerin farkına varmış ve çok geç kalmıştık. Hayatım boyunca laboratuvardan hep uzak kalmaya çalışmışken, kendimi bir anda RT-PCR deneylerinin ortasında buldum. Uykusuz geceler, haftalar süren sıkıcı pipetlemeler ve stresli birkaç ay sonunda farklı bir yaklaşımla projeyi kıl payı kurtarır gibi olduk ancak projenin başında planladığımız sonuçlardan çok uzaktaydık. Harcanan proje bütçesi ve on iki aylık bir zaman dilimi bir yana, iki büyük yatırımcı şirketin güvenini kaybetmek ve gayet açık olan o kapıların tamamen kapanması, ödenen en büyük bedeldi.
Biraz daha korkutmaya devam edeyim. Yanlış tasarlanan bir primer çifti beraberinde en az bir aylık bir zaman ve iş gücü kaybına neden olur: en az bir haftanız sipariş ettiğiniz primerlerin gelmesi için geçer, deneylere başlayana kadar ortalama iki hafta kaybedersiniz, genelde takıldığınız nokta da iyon konsantrasyonu ve erime sıcaklığının (Tm) belirlenmesidir. Bir sonraki haftayı, deneylerin neden çalışmadığını anlamak üzere her bir faktörün değiştirildiği ve insana kafayı yedirten bir dizi deneyle geçirirsiniz; bunun baskısı çok sinir bozucudur. Artık primerlerde hata olduğunu düşünmeye başlarsınız ve her bir tasarım adımını dikkatle gerçekleştirmek üzere bir sonraki haftanızı da boşa harcar ve yeni primerlerinizi sıkıntıyla beklemeye başlarsınız.
Oysa, primer tasarımında nelerin temel alındığını anlarsanız, bu aşamaları kolayca geçersiniz ve benzer olumsuz hikayelerle nadiren karşılaşırsınız. Önce PCR (1., 2. ve 3. nesil PCR) deneylerindeki ortak noktalardan kısaca bahsedelim.
PCR deneylerinde kullanılan ve özel bir DNA polimeraz enzimi olan Taq polimeraz, bir zinciri kesikli olan çift zincirli DNA'ya bağlanır. Aslında tek zincirli DNA'ya da bağlanır ama çok kısa sürede tekrar ayrılır, bunu bir örnekle açıklayayım. Kalabalık bir ortamda elindeki kağıtta ismi yazılı olan bir insanı arayan bir kişi düşünün. O ortamda sırasıyla herkese ismini sorduğunu hayal edin (aslında herkese sormaz, elindeki ismin cinsiyetini erkek olarak tahmin ediyorsa sadece o ortamdaki erkeklere sorar), aradığını bulana kadar da devam ettiğini. Ancak, aradığını bulunca o kişiyle sohbete başlasın ve yanından ayrılmasın; Taq polimeraz da tıpkı bu şekilde aradığını bulana kadar bağlanıp tekrar ayrılır, ta ki bir zinciri kesikli çift zincirli bir DNA parçası bulana kadar, ve oraya sımsıkı tutunur. Kararlı [stable] bir şekilde bağlandıktan hemen sonra, kesikli DNA zincirine her seferinde birer baz ekler; bu eklenen baz, kesikli olmayan DNA zincirindeki var olan bazı tamamlayan diğer bazdır (A ile T, G ile C karşı karşıya gelebilir). Bu işlem, Taq polimeraz DNA parçasından kopana kadar devam eder; bu kopmayı gerçekleştirmek için sıcaklık kullanılır ve bir döngü sona erer. Her seferinde mevcut DNA kopya sayısının iki katı kadar DNA kopyası ortaya çıkar. Yani, basit bir hesapla, bu işlem 1 defa gerçekleşirse ortamdaki kopya sayısı iki katına çıkar. 2 defa gerçekleşirse dört katına çıkar. 10 defa gerçekleşirse 2 üzeri 10 (1024) katına çıkar. Bir PCR deneyinde genelde bu işlem 40 defa tekrarlanır; bu da 2 üzeri 40 (yaklaşık 1.000.000.000.000) katlık bir artışa denk gelir. Ne artış ama! Tam da bu nedenle, teoride, elinizde sadece bir DNA kopyası olsa dahi bunu PCR ile çoğaltabilir ve daha fazla DNA miktarına ihtiyaç duyan başka bir deneyde kullanabilirsiniz. Çok şık ve akıllıca değil mi?
İşte PCR cihazları, bu işlemleri otomatik olarak tekrarlamak üzere geliştirilmişlerdir ve aynı zamanda sıcaklık döngüleyicisi [thermal cycler] olarak da anılırlar. Sıcaklık, her bir döngüyü başlatan ve bitiren bir araç olarak kullanılır ve bu şekilde istediğiniz kadar PCR gerçekleştirebilirsiniz.
Zihninizde bir şeyler canlanmaya başlamıştır sanırım, PCR'ın ne olduğuna ilişkin tanımı sona bıraktım. PCR, elinizdeki bir DNA parçasının belirli bir bölümünü çoğaltmak üzere kullanılan bir dizi reaksiyondur ve Türkçesi Polimeraz Zincir Reaksiyonu'dur. DNA'yı çoğaltan polimeraz enziminin çalışmasını sıcaklıkla tetikleyerek her seferinde hedef DNA bölgesinin kopyasını -yaklaşık- iki katına çıkarırsınız ve bu reaksiyonu ardarda tekrarlayarak istediğiniz miktarda DNA elde edersiniz.
Primer tasarımının hibridizasyon boyutunu bir sonraki yazıya bıraktım, diğer yazıya geçmeden önce bu yazıda bahsedilen kavramları anladığınızdan emin olmanızı öneririm; gerekirse birkaç kaynaktan PCR hakkında bilgi edinin ve zihninizdeki boşlukları mümkün olduğunca tamamlayın. Sonrası çocuk oyuncağı :) Girişte bahsettiğim çevrimiçi aracı da bir sonraki yazıda anlatmaya başlayacağım.
Sözün Özü:
Her işte olduğu gibi, o işin arka planında yer alan süreçleri ve kavramları çok iyi şekilde bilmek, yaptığınız işin de hakkını vermenizi kolaylaştırır ve hataları azaltır. Primer tasarımını başarıyla gerçekleştirmek içinse PCR tekniğinin teorisini iyi bir şekilde kavramanız gerekir.
Proje:
Birinci, ikinci ve üçüncü nesil PCR tekniklerinin temel farklarını ve kullanım alanlarını araştırın; özellikle üçüncü nesle yoğunlaşmanızı öneririm.
Meraklısına:
PCR, bu tekniği geliştiren bilim insanına Nobel Ödülü'nü kimya dalında kazandırmıştır. 1993 yılında verilen bu ödüle götüren süreç ve bu ödüle layık görülen bilim insanı hakkında hızlı bir Google araştırmasıyla birçok bilgi bulabilirsiniz.