Primer tasarımı hakkında daha detaylı bilgi almak ve Primer-BLAST adlı web tabanlı primer tasarım aracını öğrenmek için bu yazının yanı sıra yeni hazırladığım Primer Tasarımı yazı dizisine de bir göz atabilirsiniz.
Primer tasarımı her ne kadar birçok kişi için korkutucu olsa da, aslında birkaç noktaya dikkat edildiğinde gayet kolayca başarılabilen kolay bir tasarım. Primer3Plus gibi ücretsiz ve çevrimiçi araçların varlığında ise neredeyse çocuk oyuncağı. Temel sıkıntı, iyi bir primer tasarımında olması gereken şeylerin tam olarak bilinmeden bu işe kalkışılması; yardım sayfalarını ve varolan örnek dersleri [tutorial] okumadan primer tasarımı yapmaya kalkınca sonuç bir facia olabiliyor. Türkçe kaynaklar sınırlı ancak yine de hızlı bir Google aramasıyla bulunabiliyor.
Bu haliyle primer tasarımı artık biyoinformatik açısından popülerliğini yitirdi diyebiliriz; artık bu işi yapan bir çok yazılım geliştirildi ve bahsettiğim gibi çevrimiçi ve ücretsiz olanlara da kolaylıkla ulaşılabiliyor. Primer tasarımını ilgi çekici bir biyoinformatik projesi haline getirebilecek ihtiyaçlardan biri, birçok farklı primeri aynı anda aynı PCR cihazında çalışabilir hale dönüştürmek; bunu yapan yazılımlar da mevcut ancak ücretli olarak sunuluyor.
Eğer çalıştığınız laboratuvarda sınırlı sayıda örnekle ve ara sıra PCR deneyi yapıyorsanız, belki tüm primerlerin aynı sıcaklıkta optimum olarak çalışıp çalışmaması sizin için pek de önem ifade etmiyor olabilir. Ancak rutin olarak PCR çalışılan, PCR cihazlarının yoğun bir şekilde kullanıldığı ve mümkün olduğunca yüksek verimli bir şekilde kullanılması gerektiği durumlarda tüm primerlerin neredeyse aynı sıcaklıkta çalışıyor olması büyük oranda zamandan kazandırabilir ve iş yükünü gayet azaltabilir. Peki bu nasıl yapılabilir?
Herhangi bir primer tasarım yazılımını incelediğimizde (bu durumda Primer3Plus'tan bahsediyor olacağım) otomatik olarak hesaplanan primerin sıcaklığının (Tm) sadece bazlara göre değişmediği, ortamda bulunan anyon ve katyonların da büyük oranda Tm değerine etki ettiğini kolaylıkla farkedebiliriz. Hatta bunun pratik bir etkisi de var. Bir dizi primer sipariş ettiğinizde bu primerlerin bazı durumlarda hesapladığınız sıcaklıklarda çalışmadığını farkedersiniz. Bunun nedeni çoğu zaman şudur: primer tasarımı yaptığınız yazılımın varsaydığı sodyum (Na) ve potasyum (K) konsantrasyon değerleriyle (genelde bu değerleri bulmak için birkaç tıklama fazla yapmanız gerekir) kullandığınız PCR karışımının (master mix) sodyum ve potasyum konsantrasyon değerleri birbirinden oldukça farklıdır ve bu bazı durumlarda 4-5 °C farklılığa neden olur. İşin arkasında yatan nedeni farkedemediğiniz için de ya fazladan deney yaparsınız, ya da yeniden primer sipariş etmek zorunda kalırsınız.
Konumuza dönelim; primer tasarlarken belirli bir sıcaklık aralığında etkin bir şekilde çalışabilmeleri için nasıl bir tasarım yapabiliriz, ve nasıl bir programa ihtiyacımız var? Öncelikle Tm değerinin hesaplanması için kullanılan formüllere bakalım. Kabul gören birkaç formül var; bunlardan en basit olanı şu:
Tm (°C) = (4 x GC) + (2 x AT)
Bu formül 13'den fazla nükleotitlik primerler için tavsiye edilmiyor; yani pratik bir primer tasarımında kesin sıcaklık değerlerini bu formülle hesaplayabilmek mümkün değil. Ancak programlama açısından baktığımızda, primerler için önerilen 52-58 °C lik bir Tm aralığında primer tasarlayabilmek için kolay bir programlama projesi olabilirdi. Gelelim gerçek hesaplamaya.
Primer3 ve NCBI Primer BLAST web araçlarında kullanılan formül (referans makaleye buradan ulaşabilirsiniz) ise biraz daha karışık ve daha gerçekçi; bu formüller deneydeki sodyum ve potasyum değerlerini de hesaplamaya katıp daha kesin Tm değerleri sunuyor. Formül biraz karışık ve ilk gördüğümde biraz gözüm korkmuştu, ancak formülü "insani" bir şekilde görebilmek için kolay bir yol var. Bu kolay yola geçmeden önce, bahsedilen formülün yer aldığı bir web sitesinden detayları görebilirsiniz. Kolay yol şu: bu hesaplamayı daha önce bir web aracı yapmış ve kullandığı formülü de Perl programlama dilinde kodlayarak kaynak kodlarını sunmuş. Perl kodu da herhangi bir programlama diline kolaylıkla uyarlanabilir durumda. Tam olarak yerini söylemeyeceğim ancak ilgilenenler Primer3 web aracının kaynak koduna göz atarak hızlıca hesaplamayı bulabilir. Peki ya sonrası?
Otomatik primer tasarlayabilmek için seçilen hedef bölgelerden belirli şartları sağlayan primer dizilimlerini hesaplayabilmek için kullanılabilecek bazı eklenti ve paketler var; özellikle Matlab ve R'da ilgili fonksiyonlara kolaylıkla ulaşabilirsiniz. Matlab'daki "Bioinformatix Toolbox"da primer tasarımıyla ilgili örnek bir çalışma dahi mevcut. Yukarıda bahsettiğim Tm hesaplamasını da çalışmanıza dahil ettiğinizde ortaya gayet kullanışlı bir yazılım çıkarabilirsiniz. Böylece kullanıcının FASTA formatında gireceği DNA dizilimlerinin içerisinde belirli hedef Tm değerleri ve çoğaltılacak olan bölgenin uzunluk aralıkları şartlarını sağlayan bir dizi primeri otomatik olarak saniyeler içerisinde üretebilir, aynı zamanda bazı zor primerler için de yine otomatik olarak sodyum ve potasyum değerleriyle oynayarak primer diziliminin yanı sıra sodyum ve potasyum konsantrasyon değerleri de önerebilirsiniz.
Sözün özü:
Primer tasarımının arkasında yatan mantığı ve Tm değeri hesaplamasını tam olarak anlamak tasarımlarınızın deneysel olarak kolaylıkla çalışabilir olmasını sağlar. Eğer yoğun bir şekilde PCR yapan bir laboratuvardaysanız, tüm primerlerinizin sabit bir sıcaklıkta çalışacak şekilde tasarlanabilmesi için bir program geliştirebilir ve deneysel süreçlerinizin etkinliğini arttırabilirsiniz; böylelikle makale okumak veya daha fazla kahve molası vermek için fırsatınız olur:)
Proje:
Tm hesaplama formüllerinden bahsettik, acaba gerçekten de o kadar etki eder mi bu konsantrasyon meselesi? Denemek için bir Tm hesaplama web aracını ziyaret edelim ve GC oranı yüksek ve düşük olan 20 bazlık iki DNA dizisi belirleyelim. Her birini, Na ve K konsantrasyon değerlerini değiştirerek (Na veya K değerlerini her seferinde 2 kat arttırarak veya azaltarak) deneyelim ve Tm değerlerini not edelim. Aradaki fark her seferinde kaç derece olacak? GC oranı mı yoksa iyon konsantrasyonu değişimi mi Tm değeri üzerinde daha etkili olacak?
Meraklısına:
Primer3'ün kaynak kodu bir primer tasarımının nasıl olması gerektiği ve böyle bir tasarımın nasıl programlanabileceğinin somut ve okunabilir bir göstergesi. PCR'ın temellerini de anlamak çok önemli, bu animasyon birçok şeyi özetliyor.